Monitorare l'antimicrobico-resistenza nelle acque superficiali: l'esperienza della Regione Abruzzo
Premessa
La resistenza agli antimicrobici (Antimicrobial Resistance, AMR) rappresenta una delle principali sfide per la salute pubblica a livello globale. Sebbene il fenomeno sia stato tradizionalmente studiato nei settori umano e veterinario, negli ultimi anni è emersa con sempre maggiore evidenza l'importanza dell'ambiente quale serbatoio e via di diffusione di batteri resistenti, geni di resistenza e residui di antimicrobici.
In questo contesto, il monitoraggio ambientale è stato inserito tra le azioni previste dal Piano Nazionale di Contrasto all'Antibiotico-Resistenza (PNCAR 2022-2025), riconoscendo il ruolo strategico dell'ambiente nell'approccio One Health, che considera strettamente interconnesse la salute umana, animale e degli ecosistemi.
Le acque superficiali rappresentano una matrice particolarmente significativa per la sorveglianza dell'AMR. Nei corsi d'acqua possono infatti confluire microrganismi resistenti, geni di resistenza e residui di antibiotici provenienti da numerose fonti, tra cui gli scarichi degli impianti di depurazione, le attività agricole e zootecniche, l'acquacoltura e alcuni processi industriali. Le acque reflue rappresentano una delle principali fonti di contaminazione dell’ambiente, in particolare quando, anche dopo il trattamento, vengono immesse nei corpi idrici superficiali.
Tra queste fonti, gli impianti di trattamento delle acque reflue rivestono un ruolo di particolare interesse. Sebbene i processi di depurazione e disinfezione riducano significativamente il carico microbiologico, le tecnologie convenzionali possono non essere sempre sufficienti a eliminare completamente batteri resistenti e geni di resistenza (Pruden et al., 2006). Negli ultimi anni, inoltre, ai tradizionali sistemi di disinfezione basati sul cloro si sono progressivamente affiancate tecnologie alternative, quali acido peracetico, radiazioni ultraviolette e ozono, adottate anche per limitare la formazione di sottoprodotti della clorazione (Regione Abruzzo, Piano di Tutela delle Acque – Elaborato 11, Norme Tecniche di Attuazione, art. 32, comma 10). Anche queste soluzioni, tuttavia, presentano alcuni limiti nella rimozione dei determinanti della resistenza antimicrobica (Rizzo et al., 2013; Di Cesare et al., 2016; Manaia et al., 2018).
Ulteriori criticità possono derivare dalla presenza di reti fognarie incomplete, dagli scarichi di emergenza attivati durante eventi meteorici intensi e dall'impiego in agricoltura di fanghi di depurazione e reflui zootecnici. In queste condizioni, batteri resistenti, geni di resistenza e residui di antibiotici possono raggiungere i corpi idrici superficiali attraverso fenomeni di ruscellamento, lisciviazione e percolazione.
Nonostante il crescente interesse scientifico, le conoscenze sulla diffusione dell'AMR nell'ambiente sono ancora limitate rispetto a quelle disponibili per i settori umano e veterinario. In questo scenario, il monitoraggio delle acque superficiali rappresenta uno strumento fondamentale per comprendere la circolazione dei batteri resistenti nell'ambiente e integrare le informazioni provenienti dalla sorveglianza sanitaria e dal monitoraggio dei residui di antimicrobici, contribuendo a una valutazione più completa del fenomeno secondo l'approccio One Health.
Un sistema di monitoraggio costruito sul territorio
In linea con l'approccio One Health promosso dal Piano Nazionale di Contrasto all'Antibiotico-Resistenza (PNCAR 2022-2025), la Regione Abruzzo ha scelto di avviare un programma di monitoraggio della resistenza agli antimicrobici (AMR) nelle acque superficiali. L'iniziativa, sviluppata su base regionale, nasce dall'esigenza di acquisire dati sulla diffusione dei principali batteri resistenti nell'ambiente e di contribuire allo sviluppo di un sistema di sorveglianza sempre più integrato tra i settori umano, veterinario e ambientale.
Il programma è realizzato grazie alla collaborazione tra l'Agenzia Regionale per la Protezione dell'Ambiente (ARPA) Abruzzo e l'Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Abruzzo e del Molise "G. Caporale" (IZSAM). L'ARPA Abruzzo effettua il campionamento delle acque superficiali, mentre l'IZSAM esegue le analisi microbiologiche e insieme interpretano i risultati.
La definizione della rete di monitoraggio ha rappresentato una fase fondamentale del progetto. La selezione delle stazioni è stata effettuata privilegiando i corpi idrici che ricevono gli scarichi di impianti di depurazione urbani, con particolare attenzione a quelli che trattano anche reflui provenienti dalle principali strutture sanitarie regionali (Figura 1). Questa strategia consente di concentrare il monitoraggio nei punti in cui è più probabile osservare la presenza di batteri resistenti immessi nell'ambiente. La rete è costituita da nove stazioni distribuite sul territorio regionale. Ad eccezione di un sito localizzato in provincia di Chieti, tutti i punti di campionamento coincidono con stazioni già appartenenti alla rete regionale di monitoraggio delle acque superficiali, utilizzata per la valutazione dello stato ecologico e chimico dei corpi idrici. L'integrazione con una rete già consolidata consente di ottimizzare le attività di controllo e di affiancare ai dati ambientali tradizionalmente raccolti anche informazioni microbiologiche utili alla sorveglianza dell'AMR.
I punti di prelievo sono localizzati immediatamente a valle degli scarichi degli impianti di depurazione selezionati, così da valutare la presenza di batteri resistenti nelle acque recettrici. La distribuzione delle stazioni oggetto di monitoraggio sul territorio regionale è riportata in Figura 1.
Figura 1. Localizzazione dei punti di prelievo delle acque superficiali inclusi nel monitoraggio dell'antimicrobico-resistenza (AMR)
Cosa viene monitorato
L'attività di sorveglianza è focalizzata sulla ricerca di alcuni microrganismi considerati indicatori della diffusione dell'antimicrobico-resistenza nell'ambiente.
In particolare vengono ricercati:
- Escherichia coli produttore di β-lattamasi a spettro esteso (ESBL), indicatore della diffusione della resistenza alle cefalosporine di terza generazione;
- Escherichia coli resistente ai carbapenemi (CRE), indicatore della presenza di resistenze verso antibiotici considerati di ultima linea;
- enterococchi resistenti alla vancomicina (VRE), rilevanti per il loro ruolo nelle infezioni correlate all'assistenza;
- Klebsiella spp., tra i principali patogeni opportunisti associati alla diffusione di ceppi multiresistenti.
Dal campionamento al laboratorio
Il campionamento delle acque superficiali è effettuato dal personale dell'ARPA Abruzzo utilizzando contenitori sterili in polipropilene da un litro, fissati a un'asta telescopica per consentire il prelievo in sicurezza. I campioni vengono raccolti pochi centimetri sotto la superficie dell'acqua, mantenuti in refrigerazione durante il trasporto e consegnati al laboratorio entro poche ore dal prelievo. Le analisi microbiologiche vengono avviate entro 24 ore, nel rispetto delle procedure previste per garantire l'affidabilità dei risultati.
I campioni vengono sottoposti a filtrazione su membrana, tecnica che consente di concentrare la componente batterica presente nell'acqua. Le membrane sono successivamente trasferite su terreni colturali selettivi e differenziali contenenti specifici antimicrobici, che favoriscono la crescita dei microrganismi resistenti e consentono una prima stima della loro concentrazione nei campioni esaminati. Per ciascuna sessione analitica vengono inoltre impiegati ceppi batterici di riferimento per il controllo di qualità delle prove.
Dopo l'incubazione, le colonie con caratteristiche morfologiche compatibili con i microrganismi ricercati vengono isolate e identificate mediante spettrometria di massa MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization – Time of Flight Mass Spectrometry), tecnica oggi ampiamente utilizzata nei laboratori di microbiologia per l'identificazione rapida e accurata delle specie batteriche.
L'identificazione è seguita dalla valutazione della sensibilità agli antimicrobici mediante antibiogramma eseguito con il metodo della diffusione su agar, secondo gli standard internazionali EUCAST e CLSI. Questa fase permette di confermare il profilo fenotipico di resistenza dei ceppi isolati e di verificare che la crescita osservata sui terreni selettivi sia effettivamente associata ai meccanismi di resistenza ricercati.
Per la ricerca di Klebsiella spp. il protocollo prevede una fase preliminare di arricchimento colturale, seguita dall'isolamento su terreno selettivo e dalla successiva identificazione mediante MALDI-TOF MS. In questo caso il risultato viene espresso come presenza o assenza del microrganismo nel campione.
Le metodiche adottate si basano su procedure microbiologiche standardizzate e validate, requisito fondamentale per garantire la qualità dei risultati e la loro confrontabilità nel tempo. La standardizzazione delle procedure costituisce inoltre un presupposto essenziale per l'eventuale estensione del monitoraggio ad altre realtà territoriali e per lo sviluppo di sistemi di sorveglianza armonizzati a livello nazionale. Il flusso operativo del campione dal prelievo all’espressione del risultato è riportato in Figura 2.
Clicca sull'immagine per visualizzare analiticamente lo schema del flusso operativo
Figura 2. Schema del flusso operativo per il campionamento, le analisi microbiologiche e la valutazione dell'antimicrobico-resistenza nelle acque superficiali
Punti di forza e criticità
Uno dei principali punti di forza del programma è rappresentato dall'integrazione tra le competenze ambientali dell'ARPA Abruzzo e quelle microbiologiche dell'IZSAM, che ha consentito di sviluppare un sistema di monitoraggio basato su procedure condivise e su una rete di campionamento già consolidata.
Permangono tuttavia alcune criticità operative. La necessità di analizzare i campioni entro 24 ore dal prelievo impone un'organizzazione logistica efficiente, mentre le caratteristiche delle matrici ambientali possono rendere più complesse le operazioni di filtrazione e isolamento microbiologico. Anche la presenza di una flora microbica abbondante può interferire con la crescita dei microrganismi bersaglio, rendendo indispensabile la conferma delle identificazioni e dei profili di resistenza mediante tecniche microbiologiche e strumentali.
Nonostante queste limitazioni, il protocollo adottato consente di ottenere dati affidabili e confrontabili, rappresentando una solida base per il monitoraggio nel tempo dell'evoluzione della resistenza agli antimicrobici nelle acque superficiali e per il progressivo consolidamento della sorveglianza ambientale secondo l'approccio One Health.
Conclusioni
L'esperienza della Regione Abruzzo dimostra come sia possibile sviluppare un sistema di sorveglianza dell'antimicrobico-resistenza anche in ambito ambientale, valorizzando la collaborazione tra istituzioni che operano nella tutela della salute e dell'ambiente.
Il monitoraggio delle acque superficiali non sostituisce le attività di sorveglianza condotte nei settori umano e veterinario né il monitoraggio dei residui di antimicrobici, ma le completa, contribuendo a una visione più ampia della diffusione dell'AMR secondo l'approccio One Health.
Consolidare nel tempo questo sistema di monitoraggio consentirà non solo di descrivere la presenza dei batteri resistenti nei corpi idrici regionali, ma anche di seguirne l'evoluzione, individuare eventuali cambiamenti nei profili di resistenza e supportare le future strategie di prevenzione e controllo.
Bibliografia
- Di Cesare A., Eckert E.M., D’Urso S., Bertoni R., Gillan D.C., Wattiez R., Corno G., 2016. Co-occurrence of integrase 1, antibiotic and heavy metal resistance genes in municipal wastewater treatment plants. Water Res. May 1:94:208-214. doi: 10.1016/j.watres.2016.02.049. doi: 10.1016/j.envint.2018.03.044
- Manaia C.M., Rocha J., Scaccia N., Marano R., Radu E., Biancullo F., Cerqueira F., Fortunato G., Iakovides I., Zammit I., Kampouris I., Vaz-Moreira I., Nunes O.C., 2018. Antibiotic resistance in wastewater treatment plants: Tackling the black box. Environment International, 115: 312–324. doi: 10.1016/j.envint.2018.03.044
- Pruden A., Ruoting P., Storteboom H., Carlson K.H., 2006. Antibiotic Resistance Genes as Emerging Contaminants: Studies in Northern Colorado. Environ. Sci. Technol., 40, 7445-7450
- Rizzo L., Manaia C., Merlin C., Schwartz T., Dagot C., Ploy M.C., Michael I., Fatta-Kassinos D., 2013. Urban wastewater treatment plants as hotspots for antibiotic resistant bacteria and genes spread into the environment: a review. Sci. Total Environ. Mar 1:447:345-60. doi: 10.1016/j.scitotenv.2013.01.032.
Pierpaolo Piccone
ARPA Abruzzo, Distretto Provinciale di Teramo. Sezione di “Biologia e Tossicologia Ambientale, Epidemiologia Ambientale. Laboratorio di riferimento alimenti”
Alice Marchegiano
Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Abruzzo e del Molise "G.Caporale", sede di Lanciano
Federica Di Timoteo
Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Abruzzo e del Molise "G.Caporale", Teramo,
Batteriologia e Sviluppo Antigeni Batterici
